Hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum của tinh dầu Tràm Trà (Meleleuca alternifolia)
Tác giả: TS. Lê Công Nông, ThS. Lê Thanh Khang
 TÓM TẮT
Nấm sợi Fusarium oxysporum (F. oxysporum) gây hại nhiều loại cây trồng trên tất cả các bộ phận đặc biệt bộ phận gốc, rễ của cây từ cây rau màu như ớt, cà chua, bầu bí, dưa, … đến các loại cây ăn trái như xoài, sầu riêng, đu đủ, chuối, thanh long. Nghiên cứu này nhằm xác định khả năng ức chế nấm F. oxysporum của tinh dầu tràm trà (Meleleuca alternifolia). Nghiên cứu cho thấy nồng độ ức chế của tinh dầu tràm trà đối với nấm F. oxysporum được xác định là 10 µL/mL. Kính hiển vi điện tử quét (SEM) được sử dụng để kiểm tra các thay đổi hình thái của hệ sợi dòng nấm F. oxysporum. Kết quả cho thấy những thay đổi đáng chú ý về hình thái của sợi nấm.
Từ khóa: Fusarium oxysporum, tinh dầu tràm trà
ABSTRACT
Fusarium oxysporum (F. oxysporum) fungus caused yellow wilt in many plants, this fungus harmed many crops on all parts, especially the root and root parts of the plant such as peppers, tomatoes, cucumber, melon, etc. to fruit trees such as mangoes, durians, papayas, bananas, dragon fruits. The study is aimed to determine the inhibition of tea tree (Meleleuca alternifolia) essential oil against F. oxysporum. The in vitro result showed that inhibitory concentrations of tea tree essential oil against F. oxysporum was 10 μL/mL. Testing F. oxysporum morphological variations by SEM showed remarkable changes in the morphology and structure of mycelium.
Key words: Fusarium oxysporum, tea tree essential oil
Title: Antifungal activity of tea tree (Meleleuca alternifolia) essential oil against Fusarium oxysporum
1. GIỚI THIỆU
Một nghiên cứu gần đây nhất, sự kết hợp của tinh dầu tràm trà (Melaleuca alternifolia) với bảy loại tinh dầu khác đã thể hiện khả năng kháng bốn loài nấm Fusarium trong đó có Fusarium oxysporum [14]. Palfi cùng các cộng sự đã nghiên cứu 12 loại tinh dầu trong đó có tinh dầu tràm trà và chứng minh được sự ảnh hưởng của tinh dầu tràm trà lên sự phát triển của nấm F. oxysporum [20]. Thành phần hóa học và hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên thực vật của tinh dầu tràm trà có khả năng ức chế sự phát triển của năm dòng nấm bao gồm Aspergillus niger, Corynespora cassiicola, Colletotrichum sp., Fusarium oxysporum và Pyricularia oryzae với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) từ 6 – 8 μL/mL [13]. Hoạt tính kháng nấm của tinh dầu tràm trà được kiểm chứng khi thử nghiệm in vitro trên mười hai loại nấm gây bệnh ở thực vật, trong đó có nấm F. oxysporum [12].
Nấm F. oxysporum có thành phần rất phong phú và đa dạng, sự biến động của một số loài còn phụ thuộc vào khí hậu ở các vùng khác nhau trên thế giới. Nấm gây hại nhiều loại cây trồng trên tất cả các bộ phận đặc biệt bộ phận gốc, rễ của cây dẫn đến bệnh nghẽn mạch (héo), thối rễ, thối thân, thối trái và hạt. Nấm F. oxysporum sống phổ biến trong đất, lưu tồn dưới dạng bào tử áo hoặc khuẩn ty trên xác bã thực vật dư thừa và các chất hữu cơ. Một số loài tạo bào tử đính bay trong không khí, là nguyên nhân gây ra những bệnh trên thân, lá và bông. Nấm F. oxysporum là tác nhân gây bệnh thối rễ nguy hiểm nhất trên diện rộng ở đậu và cà chua [24]. Ngay cả cây thân gỗ như hợp hoan (Albizia julibrissin) cũng có thể bị héo mạch khi nấm này xâm nhập vào hệ rễ của cây [22]. Các loài nấm Fusarium có khả năng thích nghi với các điều kiện nông nghiệp khác nhau giúp nấm Fusarium lây lan rộng khắp thế giới [4].
Việc phòng trừ các loại nấm bệnh gây hại trên cây trồng hiện nay còn phụ thuộc nhiều vào hóa chất. Tuy nhiên, việc lạm dụng các thuốc diệt nấm tổng hợp dễ hình thành các dòng nấm kháng thuốc [5], nguy cơ tồn dư thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm vượt quá giới hạn cho phép [19], gây ô nhiễm môi trường, làm mất cân bằng sinh thái và độc hại đối với con người. Do đó, cần có các biện pháp thay thế được phát triển để bảo vệ cây trồng, bao gồm các tác nhân sinh học, muối khoáng và chiết xuất thực vật [23]. Trong đó, các chiết xuất thực vật khá đa dạng, dễ tìm, giá thành phù hợp và gần gũi với con người. Đặc biệt là các chiết xuất từ tinh dầu có tính kháng nấm cao, giữ vai trò quan trọng trong việc kéo dài thời gian sử dụng thực phẩm và khắc phục tổn thất do lưu trữ nông sản [6], [21].
Cây tràm trà thuộc họ Sim (Myrtaceae), có nguồn gốc từ Australia [3]. Tinh dầu của cây tràm trà chứa các thành phần chính gồm terpinen-4-ol (≥ 30%), γ-terpinene (10 – 28%), α- terpinene (5 – 13%), 1,8-cineole (≤ 15%) từ lâu đã được nghiên cứu và sử dụng ở nhiều nơi trên thế giới cho mục đích trị liệu và làm đẹp. Tinh dầu tràm trà được chứng minh là ức chế sự phát triển của một số loài nấm [9], [10], làm ảnh hưởng đến bào tử hay tác động lên sợi nấm [8]. Điển hình, tốc độ hô hấp của F. solani bị ức chế 50% bởi tinh dầu tràm trà ở nồng độ 0,023% [11]. Trong các thành phần khác nhau của tinh dầu tràm trà như terpinen‐4‐ol, γ-terpinenol, linalool, γ-pinene và β-pinene; terpinen‐4‐ol có nhiều hoạt tính kháng nấm, với nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ kháng nấm tối thiểu ≤ 0,25%, tiếp theo là 1,8‐cineole (eucalyptol) [7], [15], đã được đánh giá in vitro trên F. graminearum, F. Culmorum và Pyrenophora [23].
Từ những vấn đề nêu trên, nhiều nghiên cứu ứng dụng các hợp chất thiên nhiên, cụ thể là tinh dầu ngày càng được quan tâm và thực hiện. Nhằm góp phần thêm đa dạng các chế phẩm, thuốc diệt nấm có nguồn gốc sinh học; hạn chế nguy cơ kháng thuốc, ô nhiễm môi trường và đặc biệt là an toàn cho người nông dân lẫn người tiêu dùng. Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm F. oxysporum của tinh dầu tràm trà được thực hiện.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu được dùng trong nghiên cứu là lá và thân non tràm trà được thu mua trực tiếp tại vườn tràm trà huyện Mộc Hóa, tỉnh Long An vào tháng 03/2019. Tình trạng nguyên liệu: còn tươi, không dập nát hay thối hỏng.
Dòng nấm sợi sử dụng trong thử nghiệm:  F. oxysporum (phân lập từ cây khoai lang được thu hái tại hai tỉnh Trà Vinh và Sóc Trăng, có các biểu hiện  đặc trưng của bệnh héo vàng do nấm F. oxysporum gây ra). Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar: 200 g khoai tây, 20 g D-glucose, 20 g agar, 1 L nước cất) được dùng để phân lập nấm.
2.2. Định danh mẫu nấm bằng phương pháp giải trình tự ADN vùng ITS
Dựa vào hình thái, màu sắc khuẩn lạc, đặc điểm bào tử, sơ bộ tuyển chọn ra mẫu nấm nghi ngờ là F. oxysporum. Mẫu nấm này được định danh bằng phương pháp khuếch đại gen (PCR), giải trình tự các nucleotide vùng ITS (internal transcribed spacer - điểm sao chép bên trong) và tra cứu bằng công cụ BLAST (NCBI).
2.3. Ly trích tinh dầu tràm trà bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Trong nghiên cứu này, phương pháp chiết lỏng - lỏng được áp dụng để chiết tinh dầu ra khỏi hỗn hợp gồm tinh dầu và nước sau khi chưng cất lôi cuốn hơi nước. Dung môi được chọn để chiết tinh dầu là diethyl ether do có ưu điểm là hòa tan tốt các cấu tử trong tinh dầu, rất ít tan trong nước nên dễ dàng tách lớp, nhiệt độ sôi thấp (xấp xỉ 36°C) nên dễ dàng thu hồi dung môi.
Cân 50 g nguyên liệu tươi đã xay nhuyễn với kích thước bột nguyên liệu qua rây có đường kính lỗ 0,6 mm, cho vào bình cầu chưng cất dung tích 1000 mL, thêm vào bình cầu 500 mL dung dịch NaCl, ngâm nguyên liệu khoảng 30 phút. Lắp bình cầu vào hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước, chưng cất để thu tinh dầu từ hỗn hợp trên, bình cầu được đun nóng bằng bếp điện với nhiệt độ cố định là 100°C. Khi hỗn hợp sôi, hơi nước tạo thành sẽ lôi cuốn hơi tinh dầu bay lên và đi vào hệ thống ngưng tụ. Sau khi ngưng tụ sẽ thu được một hỗn hợp lỏng gồm nước và tinh dầu. Thu lấy hỗn hợp và cho vào bình chiết, chiết năm lần, mỗi lần chiết với 10 mL diethyl ether. Sau đó, gom toàn bộ dịch chiết và làm khan dịch chiết bằng muối Na₂SO₄ khan. Dịch chiết sau khi làm khan được cô quay và thu hồi dung môi ở 55°C dưới áp suất kém, thu được sản phẩm tinh dầu. Sản phẩm tinh dầu với hiệu suất thu hồi đạt được cao nhất là 6,42% bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước ở quy mô phòng thí nghiệm với điều kiện trích ly về thời gian (120 phút), nồng độ dung dịch NaCl (15%) và thể tích nước cất thêm vào bình cầu (500 mL) được bảo quản ở nhiệt độ dưới 4°C trong tủ lạnh cho đến khi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng nấm F. oxysporum bằng phương pháp khuếch tán trên thạch [18].
2.4. Khảo sát hoạt tính kháng nấm F. oxysporum bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
Dòng nấm sợi F. oxysporum thử nghiệm hoạt tính được nuôi cấy trên môi trường PDA.
Tinh dầu tràm trà được pha loãng với Tween 80 để được các nồng độ 0 µL/mL, 2 µL/mL, 4 µL/mL, 6 µL/mL, 8 µL/mL và 10 µL/mL. Do tính chất kỵ nước của tinh dầu, các dung môi hữu cơ khác nhau như Tween 80, ethanol, methanol, dimethyl sulfoxide (DMSO) được sử dụng để  hòa tan [16]. Trong nghiên cứu này cho thấy, tản nấm phát triển bình thường khi được nuôi cấy trong môi trường có Tween 80. Như vậy, sử dụng dung môi Tween 80 không ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm và việc sử dụng Tween 80 làm dung môi để pha loãng tinh dầu là thích hợp. Carbendazim được sử dụng như đối chứng dương và được pha thành các nồng độ tương tự như tinh dầu.
Khảo sát hoạt tính kháng nấm: cắt một mảnh nấm thuần F. oxysporum có kích thước 2 × 2 mm từ rìa của tản nấm sau ba ngày nuôi cấy ở 28°C đặt vào tâm các đĩa petri (Ф 9 cm) chứa 15 mL dung dịch hỗn hợp gồm môi trường PDA và tinh dầu tràm trà với các nồng độ khác nhau (0 µL/mL – đối chứng âm, 2, 4, 6, 8 và 10 µL/mL), rồi tiến hành nuôi cấy ở cùng nhiệt độ. Sau đó, đo bán kính tản nấm sau thời gian ủ là sáu ngày, tính bán kính tản nấm phát triển theo thời gian nuôi cấy. Tính kháng nấm của tinh dầu được thể hiện bằng sự ức chế hoặc tiêu diệt khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật [1]. Công thức tính khả năng ức chế (hiệu suất) của tinh dầu với sự phát triển của vi nấm (%) [2]:
Trong đó: R: bán kính nấm phát triển ở mẫu đối chứng âm (cm).
r: bán kính nấm ở mẫu tinh dầu (cm).
Mỗi nồng độ được lặp lại ba lần.
2.5. Đánh giá hình thái tế bào nấm sợi
Hình dạng tế bào nấm sợi sau khi xử lý với tinh dầu tràm trà được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét SEM EVO 18 (Zeiss – Đức) tại Phòng Công nghệ sinh học vật liệu và nano, Trung tâm Công nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh để kiểm tra các thay đổi hình thái hệ sợi của nấm F. oxysporum.
2.6. Thống kê phân tích số liệu
Kết quả được phân tích thống kê bằng phần mềm Minitab 16.0. Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng giá trị trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn. So sánh giá trị trung bình giữa các mẫu thử sử dụng phép thử t-Student. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0,05.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và định danh nấm F. oxysporum
Sau quá trình nuôi cấy, ba mẫu nấm (ký hiệu là ST-FO1, ST-FO6 và ST-FO10) từ các cây khoai lang bị nhiễm bệnh được phân lập. Tuy nhiên, cả ba mẫu nấm đều có màu sắc, hình thái gần như giống nhau. Nấm có màu xanh đen, phát tán đều theo hướng thành đĩa petri chứa môi trường PDA. Các tản nấm sau bốn ngày có kích thước 4,5 – 6 cm (Hình 1). Khi định danh bằng phương pháp giải trình tự ITS, cả ba mẫu nấm đều có kết quả như nhau:
Việc so sánh trình tự ITS của ba mẫu nấm bằng công cụ BLAST trên NCBI cho thấy trình tự ITS tương đồng 100% với dòng F. oxysporum (Hình 2). Kết quả này cho phép kết luận rằng ba mẫu nấm là loài F. oxysporum.
3.2. Hiệu quả ức chế của tinh dầu tràm trà trên nấm F. oxysporum bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
Với nồng độ ban đầu là 10 µL/mL, tinh dầu được pha loãng với Tween 80 ở các thang nồng độ thấp dần, từ đó xác định nồng độ ức chế. Kết quả cho thấy, xung quanh tản nấm được nuôi cấy trong môi trường có tinh dầu tràm trà xuất hiện vòng tròn tản nấm với kích thước thay đổi tuỳ nồng độ tinh dầu (Hình 3), trong khi đó, tản nấm phát triển bình thường khi được nuôi cấy trong môi trường có Tween 80.
Sự phát triển hệ sợi nấm có thể bị tác đáng đáng kể bởi tinh dầu. Theo Nikos, tinh dầu sả chanh ở nồng độ 25 ppm đã ức chế đến 70% nấm sinh bào tử, khi tăng nồng độ 500 ppm thì ức chế hoàn toàn [17]. Tinh dầu sả cho thấy tác động làm giảm nảy mầm bào tử và chiều dài ống mầm với Colletotrichum coccodes, Botrytis cinerea, Cladosporium herbarum, Rhizopus stolonifer và Aspergillus niger với hiệu quả phụ thuộc vào nồng độ tinh dầu [26]. Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng nấm gây bệnh ở thực vật của tinh dầu tràm trà ở Long An cho thấy tinh dầu tràm trà có khả năng kháng các dòng nấm sợi gây bệnh ở thực vật như các nghiên cứu trước đây. Từ kết quả nghiên cứu về khả năng kháng nấm gây bệnh ở thực vật của tinh dầu tràm trà cho thấy tinh dầu tràm trà rất tiềm năng với hoạt tính kháng nấm gây bệnh ở thực vật, khả năng ảnh hưởng rộng trên nhiều tác nhân vi sinh gây bệnh khác nhau ở thực vật.
3.3. Đánh giá hình thái tế bào nấm sợi
SEM được sử dụng để kiểm tra các thay đổi hình thái của hệ sợi dòng nấm F. oxysporum (Hình 4). Kết quả cho thấy những thay đổi đáng chú ý về hình thái của sợi nấm. Số lượng sợi nấm của F. oxysporum ít hơn, sợi nấm dài, thưa thớt và phân nhánh kém khi được xử lý với tinh dầu tràm trà và carbendazim. Như vậy, tác động của tinh dầu tràm trà trên hệ sợi nấm F. oxysporum tương tự như carbendazim.
Các nghiên cứu trước đây cho thấy, thành phần chính trong tinh dầu bao gồm phenol, terpen, aldehyde và xeton [25] và nhìn chung tinh dầu chủ yếu tác động lên màng tế bào chất của vi sinh vật. Do sự khác biệt về số lượng và thành phần tinh dầu nên đặc tính kháng nấm của tinh dầu không phải do một cơ chế cụ thể mà tác động bởi nhiều cơ chế khác nhau ở mức độ tế bào. Cơ chế được nghiên cứu nhiều nhất về hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu được gọi là "cơ chế gián đoạn". Do tính chất kỵ nước của tinh dầu nên tinh dầu có thề tấn công và phá vỡ màng tế bào, tinh dầu cũng có thể ảnh hưởng đến hệ thống enzym dẫn đến ức chế hô hấp và gây chết tế bào.
4. KẾT LUẬN
Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm F. oxysporum bằng phương pháp khuếch tán trên thạch của tinh dầu từ lá tràm trà, kết quả cho thấy tinh dầu lá tràm trà biểu hiện hoạt tính kháng nấm F. oxysporum tốt với nồng độ 10 μL/mL với hiệu suất kháng nấm là 100%. Kết quả này góp phần tạo hướng ứng dụng mới cho tinh dầu tràm trà, qua đó giúp tăng giá trị cây tràm trà ở Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Ales, P., Milan, K., Renata, V., Robert. P., Jana, S., Vladimir, K., Petr, H. R. Z., Libor, K., 2009. Antifungal activity of silver nanoparticles against Candida spp.. Biomaterials, 30(31), 6333–6340.
[2]. Amit, T. A. M. K., 2010. Liquid and vapour-phase antifungal activities of selected essential oils against Candida albicans: microscopic observations and chemical characterization of cymbopogon citratus. BMC Complementary and Alternative Medicine. Vol. 10.
[3]. Cheel, E., 1924. Notes on Melaleuca, with descriptions of two new species and new variety. Journal and proceedings of the Royal Society of New South Wales. 58: 195.
[4]. Ćosić, J., Vrandečić, K., Svitlica. B., 2004. Fusarium species isolated from wheat and maize in Eastern Croatia. Poljoprivreda. 10(1): 5-8.
[5]. Da, C. C. L., Pintom, F. V., Patriarca, A., 2013. Application of plant derived compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. Int. J. Food Microbiol. 166: 1-14.
[6]. Farzaneh, M. H., Kiani, R., Sharifi, M., Reisi, J., Hadian, 2015. Chemical composition and antifungal effects of three species of Satureja ( S. hortensis, S. spicigera, and S. khuzistanica) essential oils on the main pathogens of strawberry fruit. Postharvest Biol. Technol. 109: 145-151.
[7]. Hammer, K. A., Carson, C. F., Riley, T. V., 2003. Antifungal activity of the components of Melaleuca alternifolia (Tea tree) oil. J applied microbiology. 2003, 95:853-860.
[8]. Homeyer, D. C., Sanchez, C. J. K., Mende, K., Beckius, M. L., Murray, C. K., Wenke, J. C., Akers, K. S., 2015. In Vitro activity of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil on filamentous fungi and toxicity to human cells. Medical Mycology. 53, 285–294.
[9]. Inouye, S., Tsuruoka, T., Watanabe, M., Takeo, K., Akao, M., Nishiyama Y., Yamaguchi, H., 2000. Inhibitory effect of essential oils on apical growth of Aspergillus fumigatus by vapour contact. Mycoses 43 : 17-23.
[10]. Inouye, S., Uchida, K., Yamaguchi, H., 2001. In vitro and in vivo anti-Trichophyton activity of essential oils by vapour contact. Mycoses 44 : 99-107.
[11]. Inouye, S., Watanabe, M., Nishiyama, Y., Takeo, K., Akao, M., Yamaguchi, H., 1998. Antisporulating and respiration-inhibitory effects of essential oils on filamentous fungi. Mycoses 41 : 403-410.
[12]. Jasenka, C., Karolina, V., Jelena, P., Draženka, J., Marija, R., 2010. In vitro antifungal activity of essential Oils on growth of phytopathogenic fungi. Poljoprivreda. 16 (2): 25-28.
[13]. Khang, L. T, Huong, N. T. T., Tien, L. T. T., 2019. Antifungal activity of tea tree essential oils (Meleleuca alternifolia) against phytopathogenic fungi. International Journal of Advanced Research - 7(9), 1239 - 1248 -ISBN/ISSN: 2320-5407.
[14]. Krzyśko, L. T., Sokół, S., Piekarska, S. A., 2020. Evaluation of Fungistatic Activity of Eight Selected Essential Oils on Four Heterogeneous Fusarium Isolates Obtained from Cereal Grains in Southern Poland. Molecules 25020292. doi:10.3390.
[15]. Lahkar, S., Das, M. K., Bora, S., 2013. An overview on Tea Tree (Melaleuca Alternifolia) oil. Int. J. Pharm. Phytopharmacol. Res. 3 (3): 250-253.
[16]. Nielsen, R. R. P. V., 2000. Inhibition of fungal growth on bread, by volatile components from spices and herbs, and the possible application in active packaging, with special emphasis on mustard essential oil. International Journal of Food Microbiology, 60: 219-229.
[17]. Nikos, T. C. D. E. G., 2007. Antifungal activity of lemongrass (Cympopogon citratus L.) essential oil against key postharvest pathogens. Innovative Food Science & Emerging Technologies. Vol. 8, pp. 253-258.
[18]. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, trang 31-32.
[19]. Ogah, C. O., Coker, H. B., Adepoju, B. A. A., 2016. Organophosphate and carbamate pesticide residues in beans from markets in Lagos State, Nigeria. J. Innov. Res. Eng. Sci. 2(1): 50-61.
[20]. Palfi, M., Konjevoda, P., Vrandečić, K., Ćosić, J., 2019. Antifungal activity of essential oils on mycelial growth of Fusarium oxysporum and Bortytis cinerea. Emirates Journal of Food and Agriculture. 31(7): 544-554. doi: 10.9755/ejfa.2019.v31.i7.1972.
[21]. Prakash, B. A., Kedia, P. K., Mishra, N. K., Dubey, 2015. Plant essential oils as food preservatives to control moulds, mycotoxin contamination and oxidative deterioration of agri-food commodities potentials and challenges. Food Control. 47: 381‑391.
[22]. Phipps, P. M. and Stipes, R. J., 1976. Histopathology of mimosa (Albizia julibrissin) infected with Fusarium oxysporum f. sp. perniciosum. Phytopathology 66:839–843.
[23]. Terzi, V., Morcia, C., Faccioli, P., Valè, G., Tacconi, G., Malnati, M., 2007. In vitro antifungal activity of the tea tree (Melaleuca alternifolia) essential oil and its major components against plant pathogens. Original article. Letters in Applied Microbiology ISSN 0266-8254.
[24]. Cao Văn Thu, 2013. Vi sinh vật học. NXB Giáo Dục Việt Nam, phần III, chương 8.
[25]. Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia (ACIAR).
[26]. Weinhold, A. R. and Hancock, J. G., 2012. Defense at the perimeter: extruded chemicals. Plant Diseases, 5: 121-133.